灭菌/无菌工艺验证指导原则|2017

 1 概述 

无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。 

无菌药品通常的灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing process）和无菌生产工艺（aseptic processing）。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。 

最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10-6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。 

基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭菌方式，并系统地评估生产的各环节及各种因素对无菌保证水平的影响，根据风险的高低与风险发生的可能性等来针对性地验证灭菌工艺的可靠性，验证的内容、范围与批数等取决于工艺与产品的复杂性以及生产企业对类似工艺的经验多少等因素。只有在研发中经过系统而深入的研究与验证，获得可靠的灭菌工艺，并在日常的生产过程中严格执行该工艺，才能真正保证每批药品的无菌保证水平符合预期的要求。当然，在药品的整个生命周期内，随着对所生产的药品的特性和生产工艺等的了解越来越全面和深入，灭菌工艺也在不断的完善，此时就会涉及到对变更后的工艺如何进行验证的问题，本指导原则也适用于此种情况。 

由于灭菌/除菌工艺验证的工作在我国开展的时间不长，基础还不牢靠，因此必然在实际工作中会遇到很多难以预料的问题，故本指导原则只是一个一般性原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根据实际情况采用其他有效的方法和手段。同时，本指导原则作为阶段性产物，必将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证的认知加深，而不断进行修订与完善。 

2制剂湿热灭菌工艺 

2.1湿热灭菌工艺的研究 

2.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据 

灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树（详见附件1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。湿热灭菌法是利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。高温在杀灭微生物的同时，可能对药品的质量也有所影响。如果产品不能耐受湿热灭菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。所以，对于药品的灭菌工艺的考察和确定，首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。 

目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F0≥12）和残存概率法（8≤F0<12）。用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，则应该按照无菌生产工艺要求。 

以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用，具体选择哪种灭菌方法，在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。药物是否能耐受湿热灭菌工艺的高温，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与活性成分存在的环境密切相关，所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析，以确定能否采用湿热灭菌工艺。 

2.1.1.1活性成分的化学结构特点与稳定性 

通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性，如果活性成分结构中含有一些对热不稳定的结构基团，则提示主成分的热稳定性可能较差。在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降解试验对活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以便在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺。 

2.1.1.2 处方工艺的研究 

在对活性成分的结构特点与稳定性进行研究的基础上，可以有针对性的进行处方工艺的优化研究。如活性成分易发生氧化反应，则需要考虑是否需要在工艺中去除氧并采取充氮的生产工艺，或在处方中加入适宜的抗氧剂；如活性成分的稳定性与pH值相关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性的pH值，当然此时需要关注该pH值在临床治疗时能否接受；如果主成分是因为某些杂质的存在影响了稳定性，则需要通过适宜的手段去除相关的杂质；如果是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用的溶剂系统在临床应用时能否被接受；湿热灭菌的不同灭菌温度和灭菌时间的组合对产品的稳定性的要求有所不同，可以在保证提供所需的SAL的基础上，通过灭菌时间和灭菌温度的调整来确定药物可以耐受的湿热灭菌工艺。 

总之，需要通过各个方面的研究，使药物尽可能的可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，活性成分依然无法耐受湿热灭菌的工艺时，才能选择无菌保证水平较低的无菌生产工艺。 

2. 2.1.3稳定性研究 

无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳定性影响的试验可包括产品的降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。 

灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。因此，稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保灭菌产品的质量仍能符合要求。 

2.1.2过度杀灭法的工艺研究 

通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和日常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。 

过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品初始菌的数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分钟。因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。 

但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循GMP的要求，这一点是可以实现的。 

2.1.3残存概率法的工艺研究 

与过度杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有积累了这类有价值的信息后，才能制定比过度杀灭法F0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。使用热力较低灭菌程序更有利于药品的稳定性，使产品的有效期延长。正是因为这个原因，残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。

通常说来，不耐热药品的灭菌可能不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌程序能够恰当地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。这种情况下，灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。根据以下公式可以比较清楚的说明这一点： 

无菌保证值= F0 / D - lgN0 

其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D密切相关。 

2.1.3.1 灭菌前生物负荷的控制 

采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体的措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。 

灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺确定的过程中，也应该对滤膜的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。 

2.1.3.2 灭菌前微生物污染的监测 

灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下的方法：先用灭菌的5%吐温充分湿润0.45um的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在30~35℃下培养3~7天，计数。 
分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用以下的测定方法：先用灭菌的5%吐温充分润湿0.45um 的滤膜，然后过滤污染水平监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴上煮沸约30分钟，然后在30-35℃下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观察是否有耐热菌生长。 

当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌的D值（D值的具体检测方法详见附件2），然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。 

2.2湿热灭菌工艺的验证 

湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生物学验证两部分，物理验证包括热分布、热穿透试验，生物学验证主要是微生物挑战试验。物理验证是证实灭菌效果的间接方式，而微生物挑战试验则直接反映灭菌的效果，两者不能相互替代。 

2.2.1物理确认 

2.2.1.1空载热分布试验 

空载热分布的目的是主要是了解整个灭菌设备的运行情况，确认灭菌室内的温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。空载热分布试验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室的不同位置。温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置下的灭菌风险评估而定，应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的检测具有较好的代表性。温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后，即可以按照设定的灭菌程序进行灭菌。 

2.2.1.2装载热分布试验 

装载热分布试验的目的是了解设备在装载条件下内部的温度分布状况，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安放的位置一般同空载热分布试验，注意一定要在空载热分布试验确定的冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌的容器的周围，注意不能介入待灭菌的容器。 

装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品，如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用图表的方式说明产品的装载情况，并评估探头放置是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装载量的热分布试验需要至少进行三次。温度探头在试验前后同样均需要进行校正。 

2.2.1.3 热穿透试验 

热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度。对于药物而言，灭菌程序既要赋予产品一定的F0值，以保障产品的SAL≤10－6 。同时灭菌程序又不应使产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。 

热穿透试验所用的温度探头的个数和安放位置需要根据热分布试验的结果确定。一般可以采用足够数量的温度探头。应将热穿透温度探头置于液体容器中的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。插有温度探头的产品的安放位置包括热分布试验确定的冷点和高温点、其他可能的高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。 

热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热穿透试验也需要至少进行三次。通过热穿透试验可以确定在设定的灭菌程序下，灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够到达设定的温度。结合灭菌前微生物污染的检测，可以确定灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够获得设定的F0值。 

对于F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。 

2.2.1.4热分布和热穿透试验数据的分析处理  

在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。通常需要关注的主要参数包括 
-        每个探头所测得温度的变化范围 
-        不同探头之间测得的温度变化范围 
-        探头测得的温度与设定温度之间的差值 
-        探头测得超过设定温度的最短及最长时间 
-        F0 的下限及上限 
-        灭菌阶段结束时的最低F0值 
-        灭菌阶段的最低和最高压力 
-        饱和蒸汽温度和压力之间的关系 
-        灭菌阶段腔室的最低和最高温度 
-        热穿透温度探头之间的最大温差或F0 的变化范围 
-        热分布试验中温度探头间的最大温差 
-        最长平衡时间 
-        最少正常运行的探头数 

合格标准应结合灭菌条件、灭菌设备的特点以及产品的实际情况制定。通常情况下，灭菌柜腔室最冷、最热点和平均温度之间的温差应不超过2.5℃。保温时间内温度波动应在±1.0℃之内，如果温度差别过大，提示灭菌柜的性能不符合要求，需要寻找原因并进行改进，重新进行验证。另外对于热敏感的药物，还应该控制灭菌柜的升温和降温时间，以保证热能的输入控制在合理的范围以内，不会对产品的热稳定性造成影响。 

2.2.2 生物学确认 

湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知D值的耐热孢子（生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能达到产品所需的标准灭菌时间和F0。此项验证工作能够如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。 

2.2.2.1生物指示剂选用的一般原则 

一般情况下，生物指示剂选择的原则性要求是：孢子稳定、非致病菌、易于培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。针对具体的灭菌工艺和具体的产品，还应注意所用的生物指示剂的耐热性应强于待灭菌产品中的污染菌。 

湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物指示剂系统主要是嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。残存概率法由于其热输入量比较低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。 

2.2.2.2生物指示剂的使用和放置 

实际验证过程中可以直接采用市售的生物指示剂成品或将生物指示剂接种在待灭菌产品上。采用市售品时，只要供应商具有相应的质量体系认证资质，在测试中其提供的生物指示剂的D值就可以被接受。采用将生物指示剂接种到待灭菌产品的方法，由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐热性会有所不同，首先应考虑产品对生物指示剂耐热性的影响。所以对于具体的品种而言，如果需要将生物指示剂接种至产品之中，应测定生物指示剂在该产品中的耐热性，即D值。如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。 

生物指示剂的用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐热性来确定，其用量应符合挑战性试验的要求。生物指示剂的用量可以采用阴性分数法或者残存曲线法计算，可以根据实际情况（如污染菌的耐热性，拟用的生物指示剂的D值等）选择合适的计算方法，具体检测方法见附件3。 
应结合产品特点和热分布、热穿透的实际结果来确定生物指示剂的放置位置。装有生物指示剂的容器应紧挨于装有测温探头的容器，在灭菌设备的冷点处必需放置生物指示剂。灭菌柜的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模仿实际生产时的状况。 

2.2.2.3灭菌 

生物指示剂的验证应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。 

2.2.2.4检查和培养 

可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的包装方式，采用适当的方法进行检查和培养。将指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同的生物指示剂所需要的培养条件也各不相同，针对使用的生物指示剂确定培养条件，同时应放置阴性和阳性对照样品。 

2.2.3.5试验结果的评价 

根据生物指示剂的D值和接种量推算产品在灭菌过程中实际达到的SAL值。验证新的灭菌工艺时，每个产品的每个规格的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂验证试验。如果试验的重现性好，所有试验的结果均提示SAL≤10-6，则验证结果提示该灭菌工艺为验证合格的灭菌工艺。如果各次验证的结果不一致，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。 

3制剂无菌生产工艺 

3.1无菌生产工艺的研究 

无菌药品应首选采用终端灭菌工艺。如不能耐受终端灭菌工艺条件，应尽量优化处方工艺，以改善其耐热性。如确实无法耐受终端灭菌工艺，则可采用无菌生产工艺。无菌生产工艺通常包括无菌分装生产工艺和除菌过滤生产工艺。 

3.1.1无菌分装生产工艺的研究 

无菌分装生产工艺是将采用经验证的灭菌/除菌工艺过程处理后的原料药或者原料药和辅料，用无菌生产的方法分装到采用经验证的灭菌工艺处理的容器中，密封得到的。无菌分装生产工艺的工艺研究和生产过程控制的重点是影响无菌保证水平的工艺步骤，主要包括物料（包括原料药、辅料、内包装材料等）的质量控制、原材料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。 

关于物料的质量控制，采用无菌分装生产工艺的制剂所涉及的各种物料，都必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各种物料的灭菌/除菌工艺，都应是经过验证的、控制良好的工艺。同时需要对各种物料的无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控标准。 

无菌分装的生产工艺是将原料药或者原料药和辅料经分装设备分装至内包装材料中后密封得到。分装步骤是影响产品质量和无菌保证水平的关键生产步骤，应结合生产设备和产品特点进行工艺参数的研究，包括分装速度和分装时间等。 

无菌分装生产工艺能否达到设定的无菌保证水平，与整个生产过程的控制密切相关，应按照GMP要求及产品具体生产工艺情况进行生产环境和生产过程的控制。在进行无菌生产工艺验证时，应采用最差条件进行验证，在实际生产过程中，对生产过程和工艺参数的控制均不能超过经验证的最差条件的控制范围。 

3.1.2 过滤除菌生产工艺的研究 

过滤除菌的无菌生产工艺是通过除菌过滤器，将药液中的微生物除去得到无菌滤液。采用过滤除菌工艺时，同样需要对影响无菌保证水平的工艺步骤及工艺参数进行详细的研究，主要包括物料的质量控制、除菌过滤器的选择及除菌过滤工艺参数的研究、除菌过滤生产过程的控制等。 

对于采用过滤除菌生产工艺的制剂，需注意对配制药液使用的原料药、辅料（包括注射用水）等原材料的微生物种类及数量进行检查，掌握潜在的污染微生物的总体特性情况，通过研究确定相应的质控标准。采用过滤除菌生产工艺的制剂所使用的内包装材料，必须采用适当的经验证的灭菌工艺处理后方可使用。 

除菌过滤生产工艺所使用的除菌过滤器，通常为标称孔径0.2微米或更小的除菌级的过滤器。除菌过滤器的过滤效能是评价除菌过滤工艺的重要参数，需要对除菌过滤器的过滤效能进行验证。通常，影响除菌过滤器的除菌过滤效能的因素包括：①药液的性质，如药液的粘度、表面张力、pH值、渗透压等；② 过滤步骤的工艺参数，如过滤的压力、流速、时间、温度等；③ 除菌过滤器的相关参数，如除菌过滤器与药液的相容性、除菌过滤器的过滤总量和使用周期等。除菌过滤器的过滤效能可因产品和操作条件不同而显著不同。除菌过滤器的选择及工艺参数的研究可结合上述影响除菌过滤器的过滤效能的因素进行。在实际生产过程中，在过滤除菌前后均需要进行滤器完整性测试。由于微生物通过过滤器的概率随着待过滤溶液中微生物数量的增加而增加，除菌过滤工艺中需对待过滤溶液的微生物负荷情况进行研究和控制，通常情况下，最终除菌过滤前，料液的微生物负荷应不超过10cfu/100ml。应通过研究确定无菌生产各操作环节的时间控制范围，如料液配制后待过滤的存放时间、药液过滤操作的时间、过滤后至灌装前放置的时间、灌封操作的时间、灭菌后的内包装材料及密封件允许的放置时间等。各生产环节操作时间的确定需提供相应的试验数据。 

3.2 无菌生产工艺的验证 

无菌生产工艺的验证主要包括培养基模拟灌装试验，应当尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对无菌结果有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。新建的无菌生产工艺的生产线在正式投产前必须进行连续三批无菌培养基模拟灌装试验。在生产用的设备、设施、人员结构及工艺方法有重大变更时都应进行培养基模拟灌装试验。实际生产中每半年应至少进行一次培养基模拟灌装试验。 

对于除菌过滤无菌生产工艺的验证，还包括对除菌过滤系统的验证，如过滤器的微生物截留验证、过滤器与待过滤药液的相容性验证、过滤器的完整性验证等。 

3.2.1培养基模拟灌装试验 

3.2.1.1培养基 

培养基模拟灌装试验需要选择合适的培养基，并对培养基的质量进行控制。 
应当根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。一般选用胰胨大豆肉汤培养基（TSB），按每30g加1L过滤纯化水的比例，配制足够量。某些特殊情况下也可以选用厌氧生长培养基，如硫乙醇酸盐培养基（FTM）。 

培养基的质量控制主要包括培养基的微生物生长性能和无菌性。 

培养基的微生物生长性能：在按照标准操作规程制备培养基并灭菌后，可按照中国药典附录进行培养基微生物生长性能试验，确认所制备的培养基应出现明显的所接种的微生物的生长。 

培养基的无菌性：可按照中国药典附录进行培养基无菌性检查，结果应符合规定。 

在培养基模拟灌装试验中，需进行阳性对照试验，即取低浓度的菌种接种于进行阳性试验用的对照容器中，与培养基模拟灌装试验在同一条件下进行培养。除了中国药典附录中规定的阳性菌，建议使用生产环境中常见的微生物，如枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌，或者在同一生产环境中曾被检出过的菌种。接种量一般每个容器102以下，每个菌种接种2瓶，通常需均证实有菌生长，该培养基模拟灌装试验方有效。 

如果试验中需要使用模拟分装用粉末，同样需要对模拟分装用粉末进行选择和质量控制。模拟分装用粉末的选择一般遵循以下原则：①可以在干粉状态下灭菌，灭菌后的无菌性达到药典规定的标准；②流动性较好，可以用分装机分装；③可溶于液体培养基；④在模拟试验应用的浓度下无抑菌性。常用的模拟分装材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、PEG8000等，也可以采用培养基干粉作为模拟分装用无菌粉末。 

3.2.1.2模拟无菌生产工艺的操作过程 

培养基模拟灌装试验中使用的内包装材料的清洗、灭菌，分装设备的清洗、消毒及与产品接触的分装设备部件的清洗、灭菌、安装过程均应遵循与实际生产操作相同的标准操作规程。培养基模拟灌装试验过程中应制订取样计划，对使用的内包装材料间隔一定数量后随机取样进行无菌性检查；同时，全部与产品接触的设备表面应无菌。某些特殊情况下，如胶塞具有抑菌性，则需要考虑更换采用其他相当的但无抑菌性的胶塞。 

应当注意有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触，灌装培养基时，每个容器的灌装体积一般为1/3-1/2之间，最多不能超过容器的85%。应注意，对于冻干粉针剂的验证试验，在培养基灌装半压塞后，只需模拟样品进入和移出冻干机的过程即可，而不必模拟冻干过程，以保证一旦有细菌，能够保持较好的生存能力。同时，还应模拟一些可能造成污染的操作步骤，如抽真空，充氮等步骤。 

培养基模拟灌装试验应当尽可能模拟常规的无菌生产工艺，应当包括所有对无菌结果有影响的关键操作，包括生产中可能出现的各种干预和最差条件，各种干预和最差条件的考虑需要体现风险控制的理念。通常可能出现的各种干预和最差条件包括：①人员数量和他们的活动、换班、休息、更衣（需要时）；②设备调试，正常停车、非正常停车、意外事故（如检修等）；③采用灭菌后所允许放置的最长时间的设备或者车间进行生产；④模拟生产时间最长的批量所需的时间；⑤采用最慢的填充速度和最大的包装容器（即最长的暴露时间）；采用最快的填充速度和最小的包装容器（即容易伴随更多干预的生产情况）。总之，在试验计划中，总体研究设计和运行时间应该模拟可能出现的各种干预和最差操作条件，覆盖所有实际生产过程涉及的操作。 
培养基模拟灌装的数量应当足以保证评价的有效性，批量较小的产品，培养基模拟灌装的数量应当至少等于产品的批量。 

3.2.1.3试验结果的评价 

培养基模拟灌装试验需要对所有灌装样品进行培养和无菌检查。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应当符合以下要求： 

一旦发现污染，需要进行偏差调查，包括污染菌的鉴别、污染情况的评估、是否可以重复进行试验等等。 

3.2.2 除菌过滤系统的验证 

除菌过滤系统的验证一般包括：微生物截留研究、析出物研究、化学兼容性研究和药液吸附研究。 

3.2.2.1微生物截留研究 

过滤器的微生物截留验证的目的：除菌过滤器微生物截留试验是通过模拟实际过滤工艺，过滤含有一定量生物指示菌的溶液，确认除菌过滤器的微生物截留能力。 

过滤器的微生物截留验证的设计： 

（1）挑战用微生物的选择 

通常采用缺陷性假单胞菌作为挑战性试验用菌。在有些情况下，缺陷性假单胞菌可能不能代表最坏条件，则需要考虑采用其他细菌。如果使用其他细菌，应保证该细菌足够细小至足以挑战除菌级别滤器的截留性能，并能模拟产品中发现的最小微生物。应尽可能的进行微生物负荷的鉴别和量化研究，掌握所分离的微生物的形态学特征，为挑战性微生物的选择提供依据。 

挑战性微生物的大小可以通过其可穿过0.45微米级别的滤膜来确证。通常情况下，标准培养条件下生长的缺陷性假单胞菌，在高挑战浓度（如≧107）时，能少量穿过0.45微米级别的滤膜。 

（2）微生物截留试验条件 

在试验室模拟生产工艺条件，将定量缺陷性假单胞菌加入到料液中，进行过滤。根据实际生产条件，考虑确定微生物截留试验的过滤时间及温度、压差、流速等。建议对实际生产的过滤工艺进行一次彻底评估，包括溶剂性质（例如水性的、酸、碱、有机的）、过滤时间、工艺压差、工艺流速、工艺温度和过滤器设计规范，以便合理设计微生物截留试验条件。 

过滤时间和压差会影响细菌截留试验的结果。在完整的生产时间进行微生物截留试验可以对那些与时间有关的因素进行评估，如过滤器兼容性，完整性的维持，时间依赖性的穿透等。 

微生物截留试验过程中的压差应达到或超过实际生产过程的最大压差和/或最大流速（在过滤器制造商的设计规范内）。在验证过程中同时模拟压差和流速可能是不可能的。在设计挑战试验条件时过滤器的使用者应该确认哪个参数与特定工艺的相关性更高，以便为微生物截留试验条件的确定提供依据。 
微生物截留验证研究应包括多个批次的滤膜（通常三个批次）。在用于微生物截留验证研究的三个批次的滤膜中，至少应有一个批次是进行预研究时或使用前物理完整性测试时的数值通过但是接近（例如，10％之内）过滤器生产商提供的合格规范限值的。（3）微生物截留验证研究中使用的过滤膜的物理完整性检测数值应包括在实验报告中。物理完整性检测应使用已有规范值的水、产品或其它润湿流体来进行测试，并在进行微生物挑战前完成。 

如果微生物截留验证研究后，测试用微生物在任何过滤器的下游被检测到，那么就需要对此进行调查。如果调查确认测试用微生物能穿透完整性检测达标的过滤器，那么就应重新考虑此种过滤器在这些工作条件下的适用性。 
需要关注的是，过滤器的重复使用通常是不被推荐的。如果需要重复使用除菌级过滤器，需要说明理由，重复使用的相关参数（如过滤量等）也需要经过严格的验证后确定相应的范围。 

3.2.2.2析出物和释放物研究 

析出物指在人为或挑战性条件（如溶剂、温度或时间）下，从某一材料中脱离的任何化学组分。释放物是指在正常储存或使用条件下，从接触面上进入产品或工艺流体中的物质。潜在的析出物或释放物的来源包括但不限于：膜组件（如：成形剂、表面活性剂、抗氧化剂、残留溶剂、支架层）和塑料组件（如：封盖、外壳、支架、O型圈）。影响释放物的因素可能包括过滤液的化学性质、灭菌方法、接触时间、温度和过滤量与面积之比。有机溶液的过滤产生的释放物可能比水溶液过滤要更高。 

析出物数据可从过滤器生产商处获得，也可以由过滤器使用者进行试验取得。考虑到析出物的来源不同和影响析出物的因素较多，建议过滤器使用者在开展研究时尽可能使用实际产品，并使用与实际生产相同类型的过滤器。有些情况下可能需使用替代溶液进行试验，例如，产品会干扰分析方法或产品有抑菌性等。这时，替代溶液必须与待过滤产品性质尽可能一致。另外，也可以选择使用几种溶液来涵盖实际过滤溶液的pH、离子强度或有机成分的含量等特性。如果使用了替代溶液或几种溶液合并的方式，则必须提供溶液选择的合理依据。 

一旦确定好用于析出试验的萃取溶液（产品、替代液或几类溶液合并使用），则应在设计试验时模拟实际生产条件下最劣工况，具体应考虑诸如温度、时间、pH和预处理（如：冲洗、灭菌）工序等关键变量。析出试验应采用过滤装置处于最劣生产条件时的接触时间和温度，使用经过高压灭菌或消毒过的过滤器来完成。可以用静态浸泡或循环流动的方法。采用静态浸泡法时，过滤器在给定温度的析出溶液中浸泡一段既定的时间。而采用循环流动法时，萃取液在既定的时间内循环反复穿越过滤器。将萃取液收集并检测，从而确定其中的过滤器析出物。 

在取得过滤器萃取液后，通过分析可以确定来自过滤器的物质种类和含量。除了对过滤器析出物的种类和含量进行确定外，必要时还可以采用已被认可的生物反应性试验对其安全性进行评估。 

 3.2.2.3 相容性研究 

过滤器的相容性研究用来评估过滤装置与料液的化学相容性，以避免可能的过滤器受损或变形，并能防止料液受到释放物或微粒物质的污染。化学相容性试验应涵盖整个装置，试验的设计应考虑料液性质、过滤温度和接触时间等。由于过滤装置与过滤料液或溶剂之间可能存在诸多化学相互作用，过滤器生产商所提供的代表性的化学相容性表通常只作为过滤器使用者的参考，过滤器使用者需要进行更全面的测试。通常的化学相容性试验包括：接触料液前后的目视检查、过滤过程中流速变化、滤膜重量变化、过滤前后起泡点变化等。 

3.2.2.4 吸附性研究 

吸附是所过滤的料液中的某些成分粘附在滤膜上的过程，可能影响料液的构成和浓度。过滤器中吸附性的材料包括滤膜、硬件和支撑性材料。吸附试验条件可以根据实际生产条件确定，流速、过滤时间、料液浓度、防腐剂浓度、温度和pH值等因素都可能影响吸附效果。吸附试验中采用的检测方法可以采用产品质量标准中所确定的相关检测方法。 

4原料药无菌生产工艺 

无菌原料药是指在法定的药品标准中规定无菌检查项目的原料药。化学原料药的常用生产工艺包括化学合成工艺、微生物发酵工艺，以及采用微生物发酵产品作为起始原料的半合成工艺；而原料药的无菌工艺特指对制成的原料药进行无菌化处理的相关工艺，无菌工艺之前的生产过程不属本章节的讨论范畴。但对于用于无菌制剂生产的无菌辅料（如盐酸精氨酸、碳酸氢钠等）的无菌工艺验证也可以参考本指导原则的相关要求。 

与无菌制剂工艺相比，无菌原料药的生产工艺一般要更复杂，设备类型多种多样，且不同的工艺有不同的特点。工艺过程中的物料、内包装材料、设备（包括阀门、管道等相关部件）的灭菌和无菌传递、对接、组装等操作相比无菌制剂要复杂的多。原料药从非无菌转化成无菌状态的常用方法是通过除菌过滤来实现。该过程受料液性质影响很大，需要根据料液的性质选择适当的过滤器及滤芯的材质。另外，原料药的生产设备通常体积较大且内部结构复杂，在选择放置位置或进行投料、取样、回收操作时应考虑如何保证洁净区内的气流流向符合要求，以及如何匹配好高效过滤器的位置与设备本体之间的位置分布等。 

尽管无菌制剂和无菌原料药在生产过程和质量控制特点上存在诸多不同，但就无菌保证的基本原则，以及生产管理和验证的基本原则而言，两者的要求又是相通的。因此在生产设备、厂房设施、洁净级别及监测、灭菌工艺与方法及质量控制要求等方面，无菌原料药和无菌制剂的要求可以相互参考。 

4.1 无菌原料药生产工艺特点 

无菌原料药可以通过最终灭菌或非最终灭菌的方式获得。对于采用最终灭菌的无菌原料药，必须严格控制微生物污染、细菌内毒素和不溶性微粒的水平。由于多数原料药的耐热性较差，所以通常无菌原料药采用非终端灭菌的方式生产。 

无菌原料的精制过程和除菌过程经常结合在一起，作为生产工艺的一个单元操作来完成。目前生产上最常用的方法是无菌过滤法；即将非无菌的中间体或原材料配制成溶液，再通过0.22μm孔径的过滤器以达到除去细菌的目的。无菌原料药常用工艺包括溶媒结晶和冷冻干燥两种，前期国内也有采用喷雾干燥工艺的无菌原料药，但是多因为其生产工艺不能满足无菌工艺的验证要求而逐渐被放弃或进行了工艺变更。无菌过滤溶媒结晶工艺和冷冻干燥工艺涉及的具体设备和操作各不相同，但都采用除菌过滤的方式使料液从非无菌状态转变为无菌状态，并且要在此后的干燥、粉碎、混合以及分装过程中始终保持无菌状态。 

4.1.1 溶媒结晶工艺 

典型的溶媒结晶工艺流程包括非无菌原料药的溶解、除菌过滤、结晶、固液分离（如常用过滤、离心等方法）、洗涤、干燥、粉碎、混合、分装等过程。溶解环节应关注物料的微生物负荷、溶剂的质量、设备的微生物污染水平以及使用的料液输送动力源（如空气或氮气）的微生物污染水平。除菌过滤环节应关注滤器本身的无菌性、过滤器与料液的相容性、滤芯本身及装配后的完整性、过滤器的清洗及灭菌周期、过滤器的除菌效率、除菌滤器前料液的微生物污染水平等。结晶环节应关注设备无菌性、密封性及密封装置的可靠性、设备的清洗及灭菌周期、呼吸器的完整性及无菌性；如需加入晶种，晶种本身应符合无菌药品的要求，并且应验证晶种加入过程的无菌保证。过滤或离心环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置的可靠性、清洗及灭菌周期、呼吸器的完整性及无菌性等。洗涤环节应关注洗涤溶剂的无菌性。干燥环节应关注干燥设备无菌性、密封性能及密封装置的可靠性、清洗及灭菌周期、呼吸器的完整性及无菌性，以及真空系统的防倒吸设置（如使用真空，应在管路上安装除菌级别的过滤器）。粉碎环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置的可靠性；粉碎用气体（如使用气流粉碎机）的无菌保证、给料方式的无菌保证水平等。混合环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置的可靠性、清洗及灭菌周期等。分装环节应关注分装设备本身的无菌性或者其产品暴露洁净级别是否达到A级区标准，关注内包装材料的无菌性、内包装材料的递入方式、内包装容器的密封性以及取样环节的无菌保证。 

4.1.2 冷冻干燥工艺 

冻干无菌原料药的典型流程包括原料药的溶解、除菌过滤、冷冻干燥、粉碎、混合和分装。其中除冷冻干燥环节外，其它工艺步骤的关注重点可参考溶媒结晶工艺的相关要求。冻干工艺环节中应关注的主要问题包括冻干机本身及附属装置的无菌性、密封性能及密封装置的可靠性、清洗及灭菌周期、设备的可清洗及可灭菌性；真空系统的保证及干燥后的压力平衡，补气过程的无菌保证（宜补充无菌气体或者在冻干机上安装除菌呼吸过滤器），以及物料进出设备时的无菌保证。 

4.2 无菌原料药工艺验证 

采用终端灭菌工艺的无菌原料药工艺验证可参考制剂终端灭菌工艺验证的相关要求。非终端灭菌的无菌原料药工艺验证主要包括培养基模拟灌装验证和过滤除菌系统验证。其中的过滤除菌系统验证可参考无菌制剂的相关要求，并重点关注进入结晶罐的所有物料（如原料药、溶媒、酸碱、气体等）均应除菌过滤，并进行相关验证。 

4.2.1 验证批量 

常规生产批量较小的无菌原料药，应最大限度模拟大生产的批量。对于常规生产批量较大的无菌原料药，考虑到模拟大生产批量的可行性和实际介质培养的可行性，模拟灌装批量可以比大生产批量小，但模拟介质应能够接触到所有产品可能接触的设备内表面。并能够充分模拟实际生产可能遇到的其它各种最差条件。 

4.2.2 最差条件 

选择最差条件时，应考虑进出人数（包括维修人员）、生产材料、设备设施在无菌区的暴露时间、设备灭菌后至开始灌装前的间隔时间，以及微生物抑制因素（如温度、氮保护、抗生素）的调整和消除等。应确认模拟介质是否能接触到实际生产工艺过程中所有无菌产品可能接触到的表面，时间间隔是否具有可比性（比如溶解过滤时间应不短于实际生产过程中使用的时间），可将时间延长来模拟最差条件，如果缩短时间来模拟，需要说明/论证是否缩短时间后的条件可等同于生产工艺的最差条件。 
其它要求可参考无菌制剂的验证相关内容。 

附件1：灭菌工艺选择的决策树

溶液剂型产品灭菌方法选择的决策树

附件2：D值的测定方法 

一般可以采用毛细管暴热计时法测定污染微生物的耐热参数D值，测定主要包括以下几个步骤： 

①制样：将产品中的微生物分离，将菌膜或者孢子悬浮液分别放入注射用水或者磷酸盐缓冲液中，采用适宜的设备振动使其分散均匀，制备成浓度约为108个/ml的悬浮液，然后在沸水中加热约10分钟以杀灭可能存在的芽孢繁殖体。 

②测定：将上述悬浮液注入适宜长度的毛细管中，使每管的菌量为106个孢子，封口，置于校正过的121℃的油浴中曝热。每隔1-3分钟取出两支毛细管并迅速冷却，制备孢子溶液，培养后计数。 

③计算：根据公式lgNt=lgN0-t/D ，其中，N0和Nt分别为零时和曝热t 时间的孢子的浓度。 

由以上的D值的测定方法可知，测定所需的仪器并不非常复杂，但需要专业技术人员和经验的积累。在不具备D值测定条件时，可以采用测定污染菌的耐热性来代替。 

附件3：生物指示剂用量的确定方法。 

① 阴性分数法 

根据公式： 

F0=L×t，其中L为灭菌温度的灭菌率（Z=10），t为灭菌时间。 

SLR=FO/Dbi  ，其中SLR为spore log reduction，即孢子对数下降值，Dbi为所选用的生物指示剂的D值。 

SLR=lgNO- lgNt  ，其中NO为灭菌前容器内初始孢子数，Nt为灭菌后容器内残存孢子数。 

lgNt=2.303×lg(n/q) ，其中n为挑战性试验瓶样品总数，q为挑战性试验结果为阴性的瓶数) 

可以得到： 

lgNO  =lgNt +SLR= 2.303×lg(n/q) + FO/Dbi  =2.303×lg(n/q) + L×t /Dbi 

当湿热灭菌工艺的灭菌温度和灭菌时间确定后，L、t可以确定；生物指示剂确定后，Dbi可以确定；微生物挑战试验方案确定后，n、q可以确定。所以，通过以上的几个公式，可以计算出生物指示剂的用量，即NO。 

需要说明的是，在常规的生产条件下，如采用115℃灭菌30分钟，假定采用的生物指示剂的D值为1，那么，计算得到的生物指示剂的用量为106，这也是微生物挑战试验时常规采用的用量。 

② 残存曲线法 

根据公式： 

FT/Dbi = lgNO  +1，其中FT 为T灭菌值，即给定Z（Z=10）值下，灭菌程序在温度T下的等效灭菌时间，FT= F0/L；Dbi为所选用的生物指示剂的D值；NO为灭菌前容器内初始孢子数。 

当湿热灭菌工艺的灭菌温度确定后，L可以确定；生物指示剂确定后，Dbi可以确定；当F0设定后，即可计算出生物指示剂的用量，即NO。